Budowa mikroskopu i zasady postępowania z mikroskopem


Słownik niezrozumiałych pojęć tutaj


Wprowadzenie

Sprawcy większości chorób są niewidoczni okiem nie uzbrojonym. Z tego powodu wykonanie diagnozy fitopatologicznej jest uwarunkowane użyciem mikroskopu. Obecnie produkowane mikroskopy świetlne umożliwiają obserwowanie obiektów nawet o wymiarach 0,1-0,2 µm, czyli mikroskopy te powiększają obiekty około 1000-krotnie. Wirusy są znacznie mniejsze i dlatego można je oglądać tylko pod mikroskopem elektronowym.

W diagnostyce fitopatologicznej najczęściej wykorzystuje się mikroskop stereoskopowy i mikroskop świetlny. Mikroskop stereoskopowy jest używany do oglądania stosunkowo dużych obiektów, powiększonych 10-40 razy, wyjątkowo do 100 razy. Badane obiekty są zwykle obserwowane w świetle odbitym, chociaż mikroskop ten umożliwia również oglądanie okazów w świetle przechodzącym, gdy źródło światła jest umieszczone pod okazem. Mikroskop świetlny powiększa obiekt 100- do 1000-krotnie. Obiekt jest oglądany w świetle przechodzącym. Mikroskopy są urządzeniami bardzo precyzyjnymi.


Budowa mikroskopu świetlnego

Mikroskop świetlny składa się z części mechanicznych, optycznych i oświetleniowych.
Częściami mechanicznymi mikroskopu są:

Budowa mikroskopu świetlnego. Okular (a), tubus (b), rewolwer obiektywowy (c), obiektyw (d), statyw (e), stolik przedmiotowy (f), przysłona aperturowa (g), kondensor (h), pokrętło podnośnika kondensora (i), oświetlacz (j), podstawa (k), pokrętło ruchu drobnego (l), pokrętło ruchu zgrubnego (ł)

 

1.
Statyw. Składa się on z podstawy i ramienia tubusu. Podtrzymuje on stolik przedmiotowy i system optyczny oraz oświetleniowy.
2.
Tubus z urządzeniem rewolwerowym. Obejmuje on część górną z nasadkami okularów i część dolną, urządzenie rewolwerowe z gniazdami na 3-6 obiektywów.
3.
Stolik przedmiotowy. Służy on do przemieszczania preparatu. W zależności od typu mikroskopu, stolik przedmiotowy może być prosty i składać się tylko z prostokątnej podstawy z otworem w środku, przez który przechodzi światło. Stolik bardziej złożony zawiera również uchwyty do preparatu, pokrętła umożliwiające przemieszczanie preparatu i skale pionową oraz poziomą pozwalające ustalić umiejscowienie określonego fragmentu badanego okazu.

Częściami optycznymi mikroskopu są:

1.

Obiektywy. Obiektywy w zasadniczy sposób decydują o jakości mikroskopu. Umożliwiają one powiększone i wyraźne oglądanie obiektów. Są one zbudowane z soczewek. Na obudowie obiektywu zwykle znajdują się liczby informujące o:

  • sile powiększającej, np. 60x,
  • aperturze, od której zależy zdolność rozdzielcza obiektywu, np. 1,40,
  • maksymalnej grubości szkiełka nakrywkowego, które może być użyte, np. 0,17,
  • mechanicznej długości tubusu.
2.

Okulary. Zawierają one co najmniej dwie soczewki, które:

  • przekazują w powiększeniu do oka obserwatora obraz pośredni preparatu, tworzony przez obiektyw,
  • umożliwiają przeprowadzenie różnych pomiarów mikroskopowych. Liczba umieszczona na obudowie okularu informuje o łącznej sile powiększającej soczewek.

 

Parametry obiektywu. Nazwa producenta (a), typ (b), zdolność rozdzielcza (c), maksymalna grubść szkiełka nakrywkowego możliwa do użycia (d), siła powiększenia (e), mechaniczna długość tubusu (f)

 

Częściami oświetleniowymi mikroskopu są:

1.
Źródło światła, składające się z lusterka lub żarówki elektrycznej. Lusterko służy do skierowania światła na badany obiekt. Starsze mikroskopy nie posiadają własnego źródła światła. Są wyposażone w lusterko odbijające światło emitowane ze stojącej z boku lampy.
2.
Kondensor. Najczęściej używa się dwusoczewkowego kondensora Abbego. Kondensor jest układem optycznym ściśle współpracującym z obiektywem mikroskopu. Kondensor składa się z soczewek skupiających promienie świetlne w miejscu położenia badanego obiektu. A więc rolą kondensora jest intensywne oświetlenie obiektu. Z obudową kondensora jest związana przysłona irysowa, spełniająca rolę przysłony aperturowej. Przysłona ta reguluje wielkość oświetlanego pola.

Używanie mikroskopu z obiektywami immersyjnymi

Stosowanie obiektywów o sile powiększającej 90-100 razy wymaga użycia olejku immersyjnego umieszczonego między szkiełkiem nakrywkowym nad badanym obiektem i soczewką obiektywu immersyjnego.

Olejek immersyjny chroni przed rozpraszaniem i załamywaniem się światła. Zapewnia to lepsze oświetlenie badanego okazu. Bezpośrednio po zastosowaniu olejku immersyjnego soczewkę obiektywu należy oczyścić mieszaniną eteru i alkoholu etylowego, ksylenem, benzyną syntetyczną lub innym środkiem czyszczącym układ optyczny mikroskopu.


Ustawienie oświetlenia metodą Koehlera

Poza własnościami układu optycznego mikroskopu, stopień odwzorowania cech badanego okazu zależy zarówno od intensywności jego oświetlenia, jak i wielkości oświetlonego pola. W celu uzyskania optymalnych warunków obserwacji mikroskopem, należy ustawić jego układ świetlny według zasad Koehlera. Zgodnie z nimi należy zwrócić uwagę na bardzo istotne elementy układu świetlnego, którymi są dwie przysłony irysowe. Jedna z nich, umieszczona pod kondensorem, nazywa się przysłoną aperturową. Zmieniając średnicę jej otworu, zmienia się kąt rozwarcia stożka światła wychodzącego z kondensora, czyli zmienia się apertura. Druga przysłona, znajdująca się wewnątrz podstawy mikroskopu, nazywa się przysłoną pola. Nazwa przysłony wynika z pełnionej funkcji. Obraz przysłony pola tworzy się bowiem w tej samej płaszczyźnie, w której powstaje obraz preparatu, a więc brzegi jej otworu są widoczne na tle pola widzenia.

Aby ustawić układ świetlny mikroskopu według zasad Koehlera należy:

1.
Włączyć oświetlenie.
2.
Umieścić preparat na stoliku mikroskopowym.
3.
Otworzyć szeroko obie przysłony irysowe, tj. apertury i pola.
4.
Obracając pokrętłem ruchu zgrubnego, przybliżyć maksymalnie preparat do obiektywu.
5.
Patrząc przez okular(y) mikroskopu, obracając bardzo powoli śrubą ruchu zgrubnego oddalić szkiełko przedmiotowe od obiektywu do uzyskania zarysu obrazu preparatu.
6.
Obracając pokrętłem ruchu drobnego, uzyskać możliwie wyraźny obraz preparatu.
7.
Obracając pokrętłem do regulacji otworu przysłony pola w podstawie mikroskopu, przymknąć przysłonę pola, a następnie obracając pokrętłem podnośnika kondensora, przesunąć kondensor do położenia, w którym na tle pola widzenia uzyska się najbardziej ostry obraz brzegów otworu przysłony.
8.

Kręcąc wkrętami centrującymi kondensor w płaszczyźnie poziomej, naprowadzić obraz otworu przysłony centralnie względem pola widzenia.

9.
Otworzyć przysłonę kondensora do wielkości pola widzenia, aby obrzeże przysłony odsłaniało całkowicie pole widzenia. Dalsze otwieranie tej przysłony powoduje powstawanie szkodliwych odblasków i spadek kontrastu obrazu.
10.
Ustawić żarówkę oświetlacza w pozycji umożliwiającej widzenie włókna w płaszczyźnie przysłony apertury. W tym celu należy przemieszczać w płaszczyźnie poziomej oświetlacz żarowy. Włókno żarówki należy obserwować na tle zamkniętej przysłony apertury.
11.
Wyjąć jeden z okularów i patrząc w tubus nasadki okularowej otworzyć przysłonę apertury, aby odsłaniała ona około 2/3 średnicy źrenicy wyjściowej obiektywu. Następnie obraz włókna żarówki należy ustawić centralnie względem źrenicy wyjściowej obiektywu, po czym włożyć okular do nasadki.
12.
Ponownie ustawić ostrość obrazu.

Budowa mikroskopu stereoskopowego

Mikroskop stereoskopowy jest stosunkowo prostym urządzeniem. Jego część mechaniczna składa się ze statywu, ruchomego tubusu i podstawy. Optykę tego mikroskopu stanowią dwa okulary i zespół soczewek zamontowanych w obrotowym rewolwerze umieszczonym w tubusie. Oświetlenie tego mikroskopu zwykle składa się z lampy z żarówką umiejscowioną pod pewnym kątem nad badanym obiektem lub usytuowaną w obudowie stolika, pod obiektem.

Budowa mikroskopu stereoskopowego. Okular (a), tubus (b), zmieniacz powiększeń (c), obiektyw (d), stolik przedmiotowy (e), podstawa (f), pokrętło ruchu zgrubnego (g), statyw (h), oświetlacz (i), światłowód (j)

Utrzymanie czystości mikroskopu

Jakość oglądanego przez mikroskop obrazu zależy od czystości jego układu optycznego. Przyczyną zabrudzenia mikroskopu najczęściej jest kurz. Kurz należy usunąć przez okrężne przecieranie powierzchni soczewek suchą, miękką szmatką lub szmatką zwilżoną czystą wodą. Nie można w tym celu stosować nacisku. Gdy soczewki są zabrudzone kwasem mlekowym lub olejkiem immersyjnym, należy je przetrzeć szmatką zwilżoną ksylenem lub oczyszczoną benzyną syntetyczną. Po zakończeniu pracy mikroskop powinien zostać przykryty, np. workiem foliowym.

Mikroskop po pracy

Określanie powiększenia mikroskopu i wymiarów obiektu

Ogólne powiększenie mikroskopu jest iloczynem sił powiększających obiektywu i okularu.

Na przykład, okaz badany pod obiektywem powiększającym 40 razy i z wykorzystaniem okularu o sile powiększającej 10 razy jest powiększony 400 razy.

W celu zmierzenia obiektu należy posłużyć się mikrometrem okularowym.

Skalowanie mikrometru okularowego mikroskopu

Mikrometr okularowy jest małym, szklanym krążkiem zaopatrzonym w skalę. Mikrometr umieszcza się w obudowie okularu. Większość mikrometrów zawiera skalę składającą się z 100 jednostek (kresek). Wykorzystanie mikrometru musi być poprzedzone określeniem odległości między sąsiednimi kreskami skali, oddzielnie dla każdego obiektywu. Aby ustalić tę odległość należy użyć mikrometru przedmiotowego. Mikrometr przedmiotowy przypomina mikroskopowe szkiełko podstawowe, które jest zaopatrzone w 100-kreskową skalę z odcinkami oddalonymi co 10 µm.

Od lewej: okular i mikrometr okularowy (1), skala mikrometru okularowego (2, 3)

 

Aby wyskalować mikrometr okularowy mikroskopu należy:

1.
Umieścić mikrometr przedmiotowy na stoliku mikroskopowym.
2.
Wykorzystując obiektyw o najmniejszej sile powiększającej, ustawić jego położenie umożliwiające wyraźne widzenie skali mikrometru przedmiotowego.
3.
Przesunąć mikrometr przedmiotowy tak, aby jego skala znajdowała się w pozycji równoległej do skali mikrometru okularowego i aby odcinki początkowe (zerowe) obu tych skal znajdowały się na jednej linii.
4.
Określić najbliższą pozycję, w której odcinek skali mikrometru okularowego pokrywa się z odcinkiem skali mikrometru przedmiotowego.
5.

Obliczyć wartość jednostki mikrometru okularowego z następującego wzoru:

6.

1 jednostka mikrometru = (liczba jednostek mikrometru przedmiotowego) : (liczba jednostek mikrometru okularowego) x długość jednostki mikrometru przedmiotowego. Na przykład: (11 : 10) x 10 = (1,1) x 10 = 11 µm.

7.
Powtórzyć postępowania 1-5 dla każdego następnego obiektywu.

Zasady postępowania z mikroskopem

Mikroskop jest urządzeniem bardzo drogim i dlatego należy posługiwać się nim bardzo ostrożnie. Użytkownik mikroskopu powinien zawsze:

1.
Przenosić mikroskop w dwóch rękach.
2.
Ustawić w położeniu roboczym obiektyw o najmniejszej sile powiększającej przed zmianą preparatu lub po zakończeniu pracy z mikroskopem.
3.
Uważnie ustawiać ostrość obrazu, aby nie dopuścić do zetknięcia się obiektywu z powierzchnią szkiełka nakrywkowego preparatu.
4.
Używać do czyszczenia soczewek miękkiej ściereczki zwilżonej wodą, benzyną syntetyczną, ksylenem lub innym płynem.
5.

Nie dopuszczać do zwilżenia obiektywów środkiem innym niż olejek immersyjny (np. kwasem mlekowym).

6.

Oczyścić obiektyw po każdym użyciu olejku immersyjnego.

7.
Przykryć mikroskop, np. workiem foliowym, w celu ochrony jego optyki przed kurzem.

Cel ćwiczenia

1.
Poznanie budowy mikroskopu.
2.
Ustawienie oświetlenia mikroskopu metodą Koehlera.
3.
Określenie powiększenia mikroskopu i wymiarów obiektów.

Materiał

Mikroskop zaopatrzony w mikrometr okularowy. Mikrometr przedmiotowy. Preparat mikroskopowy z mieszaniną zarodników grzybów z rodzajów Alternaria, Fusarium i Puccinia.


Ćwiczenie

1.
Nazwij podzespoły dostępnego mikroskopu.
2.
Wykorzystując materiał przedstawiony wyżej ustaw oświetlenie mikroskopu metodą Koehlera.
3.
Określ powiększenie każdego z obiektywów posiadanego mikroskopu.
4.

Określ wymiary dostępnych zarodników z rodzajów Alternaria, Fusarium i Puccinia.


Pytania

1.
W jaki sposób można zmniejszyć lub zwiększyć ilość światła przechodzącego przez soczewki układu optycznego mikroskopu?
2.
W jaki sposób określa się ogólne powiększenie mikroskopu?
3.
Czym należy czyścić soczewki obiektywu po zastosowaniu olejku immersyjnego lub zabrudzeniu obiektywu kwasem mlekowym?
4.

Jaka jest różnica między "powiększeniem" i "rozdzielczością" mikroskopu?

5.
Dlaczego ustawienie układu optycznego według zasad Koehlera ma tak duże znaczenie dla optymalnego odwzorowania obserwowanego obiektu przez mikroskop?
6.
Czy stosowanie filtrów barwnych może zwiększyć kontrast obrazu mikroskopowego?